為了得到發(fā)酵石榴汁的優(yōu)良菌種，并確定石榴酒發(fā)酵的工藝參數(shù)，從自然發(fā)酵的石榴酒醪中分離、純化石榴酒酵母菌種；通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，確定石榴酒發(fā)酵的工藝參數(shù)。

　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離純化的菌種經(jīng)形態(tài)特征和26S rDNA D1/D2 區(qū)域序列分析鑒定為釀酒酵母。由此確定的最佳工藝條件為：溫度28℃、pH 3.8、糖度為17%、二氧化硫的添加量為100 mg/L，最終發(fā)酵的石榴酒的酒度在10%VoL左右。

    　石榴酒是以石榴為原料，經(jīng)剝皮、榨汁、發(fā)酵、澄清、陳釀而成的果酒。其色澤光亮透明，酒體純正，酸甜爽口，保留了石榴酸、甜、澀、鮮之天然風(fēng)味，含有大量氨基酸、多種維生素等，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并有生津化食、健脾益胃、降壓降脂、軟化血管、保健美容及止瀉之功效。

　　經(jīng)發(fā)酵過(guò)的石榴汁抗氧化活性與丁基羧基茴香醚（BHA）相近，明顯高于紅葡萄酒。中國(guó)石榴種植面積迅速擴(kuò)大，尤其是河南滎陽(yáng)、衛(wèi)輝等地形成了大的石榴園，產(chǎn)量已具規(guī)模，但是石榴不耐儲(chǔ)藏，除鮮食外，每年都有許多果實(shí)因不能及時(shí)消費(fèi)和加工而浪費(fèi)，特別是小果和裂果。

    　近年來(lái)，從天然石榴汁中分離得到了一株高效發(fā)酵石榴酒的菌株，通過(guò)形態(tài)特征和26S rDNAD1/D2 區(qū)域序列分析鑒定為釀酒酵母系列。對(duì)其發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，獲得了酒體純正生物功效高的石榴酒生產(chǎn)最佳工藝，并探討了石榴的綜合利用，增加了石榴及其他相關(guān)農(nóng)產(chǎn)品的附加值。對(duì)提高石榴經(jīng)濟(jì)效益，保護(hù)和發(fā)展石榴產(chǎn)業(yè)有著非常重要的意義。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

    　石榴：購(gòu)自河南省新鄉(xiāng)市衛(wèi)輝。菌種：從石榴汁自然發(fā)酵醪中分離。分離及保藏培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，蔗糖1%，石榴汁40%，瓊脂2%。菌種鑒定材料：引物NL1（5’—GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG—3’）和NL4（5’—GGT CCG TGT TTC AAG ACG G—3’），由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。酵母基因組DNA提取試劑盒（Solarbio 公司），PCR buffer、Tag 酶、dNTP（寶生物工程（大連）有限公司）。

    　1.2 主要儀器

    　PCR儀為T(mén)—Gradient （德國(guó)Biometra公司）。

    　1.3 方法

    　1.3.1 菌源的制備取壓榨好的石榴全汁置室溫進(jìn)行自然發(fā)酵，使石榴汁內(nèi)的酵母大量繁殖，待有大量氣泡并有較濃酒味產(chǎn)生時(shí)，即可供分離石榴酒菌源。

    　1.3.2 菌種的分離、純化取上述發(fā)酵好的石榴酒醪進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)鶆蛲坎贾练蛛x用的瓊脂培養(yǎng)基上，22℃—24℃恒溫培養(yǎng)36h，挑單菌落培養(yǎng)直至純化。

    　1.3.3 菌種的鑒定純化后的菌株經(jīng)菌落形態(tài)觀察和鏡檢，初步確定為酵母菌。同時(shí)，根據(jù)酵母菌分類(lèi)學(xué)研究標(biāo)準(zhǔn)方法做分子鑒定。酵母核基因組的提取使用酵母基因組DNA提取試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)操作。

　　使用引物NL1和NL4進(jìn)行26S rDNA D1/D2區(qū)的擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)液的組成（采用50μL體系）：每管中含PCR緩沖液（10×）5.0μL；25mmol/LMgCl2 3.0μL；10mmol/LdNTP1.0μL；10μmol/LNL1 和NL4 各1ul；0.5 U/ul DNA 聚合酶0.3 μL；10ng/ul —1000ng/ul 模板DNA1.0μL；最后添加ddH2O 定容50μL。PCR循環(huán)次序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min20s；循環(huán)36次；再72℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，由英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

    　1.3.4 發(fā)酵工藝的確定

       發(fā)酵溫度的確定。
　　將石榴汁的糖度調(diào)整為19%，pH調(diào)為4.0，添加SO2量為80mg/L。接種等量的石榴酒酵母，分別置于24℃、26℃、28℃、30℃、32℃5個(gè)溫度梯度下培養(yǎng)。待不再有氣泡產(chǎn)生時(shí)停止發(fā)酵，用來(lái)測(cè)定其殘?zhí)呛途凭取?/P>

    　發(fā)酵pH的確定。

　　將石榴汁的糖度通過(guò)添加蔗糖調(diào)整為19%，添加SO2量為80mg/L，調(diào)pH分別為3.8、4.1、4.4、4.6、4.8，接種等量的石榴酒酵母，置于28℃下發(fā)酵。待不再產(chǎn)生氣泡時(shí)停止發(fā)酵，測(cè)定其殘?zhí)呛途凭取?/P>

    　不同糖濃度發(fā)酵的試驗(yàn)。

　　利用蔗糖，將石榴汁的糖度分別調(diào)整為13%文章來(lái)源華夏酒報(bào)、15%、17%、19%、21%5個(gè)梯度，添加SO2量為80mg/L，調(diào)節(jié)pH為4.0，接種等量的石榴酒酵母。置于28℃下發(fā)酵。待不再產(chǎn)生氣泡時(shí)停止發(fā)酵，測(cè)定其殘?zhí)呛途凭取?/P>

　　SO₂添加量的確定。

　　將石榴汁糖度調(diào)整為19%，pH調(diào)為4.0，分別選擇SO2的添加量為40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L、120mg/L。接種等量石榴酒酵母，置于28℃下發(fā)酵。待不再產(chǎn)生氣泡時(shí)停止發(fā)酵，測(cè)定其殘?zhí)呛途凭?。正交試?yàn)因素水平測(cè)試。以溫度、pH、糖度、SO₂的添加量為因素，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)（見(jiàn)表1），以確定各因素的最佳用量。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 石榴酒酵母的分離鑒定

　　從自然發(fā)酵的石榴酒醪中分離出的酵母的菌落形態(tài)可以看出，所分離菌種的菌落形態(tài)特征為：菌落乳白色，圓形較大，中間突起，濕潤(rùn)有光澤，邊緣成浸潤(rùn)狀。經(jīng)鏡檢其細(xì)胞為橢圓型，能進(jìn)行出芽繁殖，符合果酒酵母的典型特征。

　　經(jīng)BLAST分析及序列相似性計(jì)算，所分離出的被測(cè)菌株的26S rRNAD1/D2 區(qū)基因序列與模式菌株（U44806）同源性為99.4%，被鑒定為釀酒酵母。

　　2.2 發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)結(jié)果

　　在適宜的溫度、pH、糖濃度下，酵母菌的生長(zhǎng)繁殖和代謝速度都很迅速，較低的pH還可以保證添加的SO2以較多的游離態(tài)存在，更好地起到抑制有害微生物的作用。因此，試驗(yàn)對(duì)上述參數(shù)進(jìn)行了單因素試驗(yàn)。

    　通過(guò)發(fā)酵過(guò)程觀察發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵溫度高，發(fā)酵完成快，殘?zhí)歉撸凭鹊?，果酒風(fēng)味不足；發(fā)酵溫度低，發(fā)酵完成較慢，殘?zhí)堑?，酒精度也高?/P>

　　從不同溫度下發(fā)酵樣品的殘?zhí)呛途凭冉Y(jié)果來(lái)看，26℃是最適的發(fā)酵溫度。

　　由不同pH下發(fā)酵樣品的殘?zhí)呛途凭鹊慕Y(jié)果可以看出，不同pH對(duì)石榴酒發(fā)酵結(jié)束的殘?zhí)菐缀鯖](méi)有影響，在pH4.6時(shí)殘?zhí)禽^低，但酒精度也低。在pH3.8時(shí)產(chǎn)酒精度最高，在pH超過(guò)4.4時(shí)雖然也能達(dá)到相同的酒精度，但發(fā)酵后石榴酒的顏色發(fā)黃，失去了原本的深紅色，影響石榴酒的外觀效果。因此，確定石榴酒酵母發(fā)酵的最適為pH3.8。由不同糖濃度下發(fā)酵的樣品的殘?zhí)呛途凭鹊慕Y(jié)果可以看出，隨著發(fā)酵初糖的提高，發(fā)酵結(jié)束時(shí)的殘?zhí)且搽S之增加，而最終酒精度也逐漸隨之增加，在糖度為19%時(shí)達(dá)到最大，而后又開(kāi)始下降。

    　因此，并不是糖度越高，酒精的轉(zhuǎn)化率就越高，過(guò)高的糖度可能會(huì)抑制酵母菌對(duì)糖的利用。這可能是糖度過(guò)高時(shí)，酵母菌所處環(huán)境的滲透壓超出了其所耐受的能力，從而抑制了其生理活動(dòng)。

　　從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，石榴酒酵母發(fā)酵的最適糖度為19%。在果酒釀造過(guò)程中都會(huì)添加一定量的SO₂，起到抑制雜菌、護(hù)色、澄清、增酸和改善口味等作用。但添加過(guò)多會(huì)影響酒的風(fēng)味、抑制酵母菌的發(fā)酵及出現(xiàn)酒液中殘留硫量超標(biāo)等危害。由SO₂對(duì)石榴酒發(fā)酵結(jié)束的殘?zhí)呛途凭鹊挠绊懣煽闯?，SO₂對(duì)石榴酒發(fā)酵結(jié)束時(shí)的殘?zhí)菨舛葞缀鯖](méi)有影響，對(duì)最終酒精度的影響也較小，均為6%左右，而添加量為80mg/L 時(shí)酒精度稍高一點(diǎn)，為6.1%。

    　2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

    　發(fā)酵溫度、pH、糖度（%）和SO2的添加量（mg/L）4因素正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

　　由表2 可以看出，對(duì)酒精度影響程度的主次順序?yàn)樘嵌龋–）＞ 溫度（A）＞pH（B）＞SO2的添加量（D），即糖度、溫度和pH 對(duì)石榴果酒的酒精度影響較大，而SO2的添加量對(duì)石榴酒酵母發(fā)酵的影響較小，其最優(yōu)方案為A₂B₁C₁D₃，即溫度為28℃，pH為3.8，糖度為17%，SO₂的添加量為100mg/L時(shí)，石榴酒酵母發(fā)酵石榴汁產(chǎn)酒度最好。

    　3 結(jié)論

    　研究從自然發(fā)酵的石榴酒醪里分離出了一株能高效發(fā)酵石榴汁的酵母菌種，通過(guò)基因組分析初步鑒定為釀酒酵母。

　　通過(guò)正交優(yōu)化試驗(yàn)，獲得了最佳石榴酒釀造條件，并確定了釀造過(guò)程中影響酒精度因素為糖度＞溫度＞pH＞二氧化硫添加量。

　　石榴酒艷若朝霞，果香純正，優(yōu)雅，更因其獨(dú)特的食療保健作用，極具發(fā)展?jié)摿?，發(fā)展果酒符合國(guó)家產(chǎn)業(yè)政策的要求。而做好研究為石榴酒規(guī)模生產(chǎn)提供了重要參考。大力發(fā)展石榴果樹(shù)栽培，選育優(yōu)良品種，對(duì)開(kāi)發(fā)石榴酒等系列產(chǎn)品很重要。

表1  正交試驗(yàn)因素水平

表2  石榴酒發(fā)酵工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果